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CAS No.: 58-58-2

嘌呤霉素二盐酸盐

嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)产生的一种氨基糖苷类抗生素,可干扰核糖体上的肽转运,造成翻译终止,进而抑制蛋白质合成,对革兰氏阳性菌、动物细胞、昆虫细胞均有杀伤作用。

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描述

嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)产生的一种氨基糖苷类抗生素,可干扰核糖体上的肽转运,造成翻译终止,进而抑制蛋白质合成,对革兰氏阳性菌、动物细胞、昆虫细胞均有杀伤作用。

链霉菌中的嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC),赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性可用于筛选特定携带pac基因的稳定转染细胞株。嘌呤霉素作用迅速,在低浓度下即可快速导致细胞死亡,一般筛选周期为一周。贴壁哺乳细胞对浓度为1 µg/mL - 10 µg/mL的嘌呤霉素敏感,悬浮细胞一般为0.5 µg/mL - 2 µg/mL。

保存条件

固态-20℃保存,至少一年有效。溶液-20℃避光保存,有效期6个月。溶液应避免反复冻融。

使用方法

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达细胞株,需要确定杀死未转染或未转导细胞的嘌呤霉素的最低浓度。初次实验建议建立适合自身实验体系的杀死曲线(Kill curve),即剂量-作用曲线。 1.杀死曲线的确立: (1) 以24孔板为例,在板内以5 - 8×104 cells/孔的密度铺板,37℃孵育过夜。 (2) 用含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基换液(如0 µg/mL - 15 µg/mL,至少设置5个浓度梯度),37℃继续孵育细胞。 (3) 24h后继续更换新鲜的筛选培养基,并观察细胞存活率。 (4) 此后根据细胞生长状态,约2 - 3天更换新鲜的筛选培养基。 (5) 每日观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始4 - 6天内有效杀死非转染或所有非转导细胞的药物最低浓度。 2.转染细胞株筛选: (1) 细胞转染含有pac基因的质粒48h后,将细胞(原样或稀释)置于含有适当浓度嘌呤霉素(一般最低浓度为杀死曲线确定的最低浓度)的新鲜培养基中培养。 注意:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。 (2) 每隔2 - 3天,移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。 (3) 筛选7天或更长时间后评估细胞形成细胞集群的情况,这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。 注意:每日进行细胞生长状态的观察时,嘌呤霉素的筛选至少需持续48h,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3 - 10天。 (4) 转移和放置5 - 10个抗性克隆到直径35 mm的培养皿中,用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。

注意

1.嘌呤霉素为有毒化合物,操作时请小心拿放,穿实验服并佩戴一次性手套。 2.配制存储液时,须使产品完全溶解后再进行过滤除菌,否则过滤时会造成药物损失。 3.本产品不可进行高压灭菌。 4.本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床、食品或药品。

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