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PNA:核苷酸的“替身”

类型:技术文章 时间:2022-08-11

“中心法则”深深刻入每个生物人的内心。作为法则中的主要成员,DNA和RNA,不可不谓“全员皆知”,然而,与它们“一字之差”的PNA,很多人可能未曾听说。


1991年丹麦科学家PETER E. NIELSEN等人,以其天马行空的想象,将酰胺键替代DNA原有的脱氧核糖磷酸骨架,设计出了人造分子PNA (Peptide nucleic acid,肽核酸),不仅能像DNA一样储存遗传信息,还具有类似蛋白质的“骨架”,化学性质比普通DNA更稳定。PNA作为一种优良的寡核苷酸取代物而被广泛地应用于分子生物学研究及相关领域,是一种非常有前景的探针工具。

PNA

从化学结构上来看,PNA是一种以中性酰胺键为骨架的DNA类似物,可序列特异地靶向并作用于核酸,其骨架的结构单元为2-氨乙基甘氨酸,碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N端上(图1)。PNA分子既非蛋白也非核酸,且目前已知的核酸酶和蛋白酶都不能识别这种独特的结构。因此,不论是在体内还是体外,PNA在广泛的pH条件下都能保持长时间稳定,不易被降解。PNA分子骨架不含戊糖和磷酸基团,故呈电中性,这种电中性的特征赋予PNA独特的优势,如高灵敏度高特异性非盐依赖性高稳定性等,都是DNA探针所没有的[1,2]


图1:PNA的化学结构[2]

PNA与DNA结合的方式

由于PNA不带负电荷,与DNA之间不存在静电斥力,因而两者结合的稳定性大大提高。研究表明,PNA与DNA的结合主要有4种方式,包括(图2)[2]

1、含有与靶DNA同型嘌呤的PNA能够直接嵌入双链DNA中。

2、PNA双重双链嵌入,能够形成稳定的复合物,但只能发生在含有修饰碱基的PNA分子上。

3、富含胞嘧啶的PNA能够与其互补的靶DNA结合形成三螺旋结构。

4、PNA与DNA中的目标位点结合,形成了PNA-DNA-PNA稳定的三链体。


图2:PNA与DNA结合的方式[2]

PNA的合成

1.Boc法:在20世纪50和60年代,Merrifield提出了固相化学合成的原理。在早期工作中,Merrifield使用苄氧羧基(Boc)来保护α-氨基。随后Boc的发展是为了增加在温和条件下脱保护的产率。在PNA的合成中,Boc保护基团可用来保护环外氨基[3]

2.Fmoc法:Boc法有着许多缺点,最具劣势的一点是会用到危险化学品。而Fmoc方案可以避免使用Boc法中的强腐蚀性化学物质,但在合成过程中需要对氨基进行保护。因此,二苯基甲基氧羧基(Bhoc)可作为最好的候选者[2]。目前多种PNA产品均采用该方法合成,如Fmoc-PNA-C(Bhoc)-OH(CSN44132)、Fmoc-PNA-T-OH(CSN44133)与Fmoc-PNA-G-(Bhoc)-OH(CSN44134)。

PNA的应用

1. 调节基因表达

首先,由于PNA能与DNA形成稳定的三链体/链侵入/链替代复合物,因而,能够终止转录过程,起到拮抗基因表达的作用。其次,PNA可通过其反义作用,阻碍以mRNA的编码区为靶标的翻译,抑制基因的表达。由此,PNA通过靶向DNA/mRNA的作用,可以完成对基因表达的调控[2]

2. 细胞导入

用作基因治疗药物的PNA寡聚物,一般含约15个核碱基、相对分子质量约3000,其物理性质主要由亲水性分子决定,很难透过细胞的脂质膜。但由于PNA是采用类似合成肽的技术制备,因此,通过衍生和修饰,可以改善PNA寡聚物在细胞中的摄入效率,如将PNA与细胞透过肽、核定位信号肽偶合,或与亲脂性基团偶合等[2]

3. 探针技术

对特定的核酸序列进行快速精准检测,这一技术在生物医药研究、疾病诊断、环境监测以及工业和临床标本的检测分析中都起着至关重要的作用。PNA的特点使之能成为一种方便快捷的检测模式,优越性大大超过了其他DNA探针。PNA在复杂生理环境中具有优异的代谢稳定性,与天然核苷酸也具有杂合能力,这两项优势使其成为了一种理想的传感器件。如侯建军等[3]就发现,PNA技术可以作为一种探针用于检测赤潮生物。徐梦佳等[4]利用PNA技术作为识别元件,构建一种可用于检测活性蛋白质的通用型比色核酸生物传感器,并且以凝血酶为例,借助核酸适体(Aptamer)实现了对血清样品中凝血酶的灵敏、可视化检测。


虽然PNA已经发展了三十年,但是每年仍会产生大量的理论与技术创新,并配合新的应用场景。目前限制PNA应用爆发的原因之一是还未实现大规模的商业化合成。未来,当体外大规模PNA合成技术突破之后,该领域一定会迎来更大的机遇。

CSNpharm作为一家全球领先的小分子化合物供应商,拥有应用广泛的PNA化合物(https://www.csnpharm.cn/pna.html),可用于PNA探针的开发与应用。此外,还有多种与DNA合成以及RNA合成相关的化合物,是发现新药物靶标的有利工具!需要进一步了解PNA相关化合物,可登录CSNpharm网站咨询。

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参考文献:

1.何为,马立人. 肽核酸. 化学工业出版社,2003.

2.Pellestor F,Paulasova P. The peptide nucleic acids (PNAs),powerful tools for molecular genetics and cytogenetics. Eur J Hum Genet. 2004 Sep;12(9):694-700.

3.侯建军,黄邦钦,赖红艳.肽核酸探针技术在赤潮生物检测中的应用[J]. 中国公共卫生,2005,21(12): 1524-1526.

4.徐梦佳. 基于功能肽核酸探针的生物传感器构建及其在疾病标志物快速检测中的应用研究[D].中国科学院大学(中国科学院宁波材料技术与工程研究所),2020.


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